1、 蛋白與膜的結合原理

蛋白與膜的結合原理， 已知的結合力包括疏水作用力\H鍵\靜電作用力等，確切的結合原理并不明確，主要靠假說來支撐。主要有兩種假說:

（1） 首先兩者靠靜電作用力結合， 然后靠H鍵和疏水作用來維持長時間結合。

（2） 首先兩者靠疏水作用結合， 然后靠靜電作用來維持長時間結合。

兩條假說， 都表明其結合過程分為兩步， 首先結合和后面長時間結合。由于結合原理的不明確性， 導致在這方面的工作非常依賴實踐經驗。

 

2、 膜對結合的影響

（1）膜孔徑

有些技術人員傾向使用膜孔徑來區分不同的膜，但是請注意這只僅僅限于同一廠家的產品，如果是不同廠家的產品，這種比較是無意義的。膜孔徑與層析速度的關系，已在上文描述。

隨著膜孔徑減小，膜的實際可用表面積遞增，膜結合蛋白的量也遞增。估量表面積的參數為表面積比率(實際可用表面積與所用膜平面積的比率)。

另外， 膜孔徑越小，層析速度也越小，那么金標復合物通過T線的時間也就越長，反應也就越充分。

綜合以上兩點，結論為膜孔徑越小靈敏度越高。但是同時也減慢了跑板速度，增加了非特異性結合的機會，也就是假陽性越高。所以要按照試驗結果挑選適合實際項目的膜，找到合適的平衡點。

（2）不同廠家的膜差異

這個差異主要來源于兩點：

A、生產膜時，使用的聚合物和表面活性劑的來源，類型，數量不同。同理，在膜處理中這兩類物質一般會對性能產生較大影響。

B、處理過程不同。

 

3、 生物原料，緩沖溶液的試劑和配方

（1）生物原料

 作為CT線的生物原料使用情況各異，所以這里只做略述。

首先，單克隆抗體與膜的結合優于多克隆抗體， 主要時由于多克隆抗體有很多不同的表面位點， 而各位點與膜的最佳結合條件都有細微的差別， 毫無疑問就增加了優化難度。

其次，分子量越大，蛋白越難結合到固相材料上。

（2）緩沖液

大家最關心的可能就是希望獲得一個性能優良的配方，包括緩沖液，封閉液等等處理溶液配方。

其實我也無法提供給你一個萬用配方清單。因為不同的反應體系需要不同的配方來支持， 而不同機構的反應體系又有差異。想獲”魚”先學”漁”。為了不誤導大家，我在下面涉及到配方的問題上，僅提供思路，具體配方請自己摸索。

緩沖液的構成一般是: PBS(或其他緩沖體系)+作用物質(針對某一特定問題)+PH調整。我在參考過以前的各種資料后，個人意見為配方原則為宜簡不宜繁，根據自己的需要添加作用物質，原來的很多需要添加的作用物質，由于膜制造技術的改進已經不再需要。

推薦的緩沖體系為0.01M PBS PH7-7.2, 該緩沖體系對多種抗原抗體都有良好的適應性。

作用物質的情況大致羅列如下:

少量NACL,減少信號強度，消假陽。

有機醇(甲醇，異丙醇等)，潤濕膜，減少膜帶有的靜電，利于結合包被。個人不推薦，因制膜工藝改進。

表面活性劑(TW20,TX100)，增加親水力，可避免線條中空現象，也可增色。

糖保護劑，減緩老化速度，也可以增加親水力同上。

調PH到某個位置，可以消假陽。

 

4、 點樣環境

環境濕度對點膜過程非常重要。最佳濕度一般在45-65%。

濕度過低，膜上容易聚集靜電荷，點膜容易出現散點，導致測試會出現疏水斑。

濕度過高，膜上毛細作用加強，點膜容易引起CT線變寬甚至擴散。

為了保證點樣時膜濕度的均一性，一般在點樣前把膜放到該濕度條件下平衡一段時間。

 

5、 點樣儀器與膜面情況的關系

目前有兩種點樣方式，劃膜式和非接觸點膜式。非接觸點膜式優于劃膜式，進口劃膜式優于國產劃膜式。

因劃膜式為軟管將抗體劃到膜表面，而膜本身的物理性質為軟脆，劃管會在其表面留下印痕。進口的劃膜機由于使用的材料和控制系統較好，所以留下的劃痕較輕，而國產儀器較差，留下的劃痕也就比較嚴重。劃痕容易對層析的金標復合物形成阻力，導致假陽性。同時容易出現跑板時在T線位置出現若有若無一條細線(鬼線)，而跑板結束后鬼線消失的奇怪現象。

 

6、 膜的寬度與點樣位置

膜的寬度一般有18mm(or 20mm)和25mm兩種， 分別使用在做測試條和做測試板上。

然而，不同的T線點樣位置將帶來不同的靈敏度。點樣位置上移，金標復合物通過T線位置時速度變慢，反應時間增加，靈敏度升高。反之靈敏度降低。這個方法可以用來改變靈敏度和消除假陽性。

 

7、 溶液在膜上的擴散

溶液在膜上的點樣量一般情況下為1ul/cm.

溶液在膜上的擴散是趨向兩端的，噴點上去的是均勻的抗體溶液，但當干燥時線條邊緣的干燥速度高于中間，中間的抗體會不斷向兩邊擴散，所以干燥后抗體是向線條的兩端聚集的。一般情況下不影響你的試驗。如果你發現線條出現兩端紅，中間淡的現象，就要考慮這個問題了?？梢约尤缟厦嬲f的作用物質來解決。

 

8、 點膜前后的封閉作用

從供應商處購買回的膜基本上都是已經優化處理好的，直接點膜就可使用。然而我們還是經常會遇到關于封閉的討論。

其實封閉不象大家認為的那樣，一封閉什么問題都解決了。老問題走了新問題又來了，而且更麻煩，我要說的是慎用封閉。

我極其反對點膜前封閉的做法。原因為廠家在生產膜時候，各種配方是混合加入原漿的。而點膜前封閉時要將膜浸泡在封閉液內，必然擾亂了膜內正常的物質分布。由此引發了許多問題，也降低了工作效率。也有廠家遇到不封閉就無法包被上膜的問題，其實可以通過其他辦法來解決，封閉必然是下測。

我經常使用的封閉手法有兩種。

流動封閉，將作用物質處理在樣品墊上。

膜上定點封閉，將作用物質配成溶液噴點在膜的特定位置上。該方法需要使用BIODOT的AIRJET噴頭?？梢詫⒉缓细竦陌氤善反蟀逯匦聫突?。

只要是將封閉做在了膜上，就必然會對產品的穩定性造成影響。具體的影響程度要通過穩定性測試來評判。

 

9、 膜的儲存

剛生產出的膜一般含有5-10%的水分。關于膜的老化機理，有個理論支持，不過爭議比較大。理論認為:膜的老化是因為膜上的水分蒸發，使膜變得疏水，帶電荷并變脆。儲存膜一般要求是避光，密封。過干或過濕都不利。在這種保存條件下，一般可以放置兩年。但是如果膜上做了封閉處理，就要根據具體試驗情況來判斷了。

有些膜由于生產工藝的問題，使用后靈敏度會在一段時間內發生變化，遇到這種問題，就需要在點膜后放置一段時間，待穩定后方可進入調試生產。